面对质疑的韩春雨 考验着科学共同体的神经

面对质疑的韩春雨 考验着科学共同体的神经
  文章来源:知识分子微信公众号

  “他们要是愿意实名出来,我们就让重复实验成功的人实名出来。”韩春雨这番针对实验重复失败的科学家的话,10月10日早上出现在《韩春雨就“重复实验失败”答科技日报记者问》一文中。

  当天晚上10时47分,中青在线率先报道了北京大学教授魏文胜等12名学者实名公开他们没能“重复”出韩春雨的实验,其实验方法“让人怀疑”的消息。

  15分钟后,在与《知识分子》的电话连线中,韩春雨表示不希望公布重复出他NgAgo实验结果的实验腾讯分分彩软件室。他表示,“学校(指河北科技大学,编者注)跟我一样,是明确知道哪几家(实验室)做出来了,和实验室都有接触”,“我不会说出他们的名字,但过一阵你会知道”。他补充说,“担心他们受到媒体骚扰”,“我不能让人家当挡箭牌”。

  “别人认为这对我是一个信誉危机,我不认为,我认为这就是一个学术问题。他们(指声明实验重复失败的科学家)说做不出来,我去解决他们的问题,这是很正常的。这不涉及信誉危机。”韩春雨在电话中说。

  将近1小时的通话结束后,韩春雨说自己还要接着做实验。次日(10月11日),《知识分子》应约来到位于石家庄槐北路43号的河北科技大学韩春雨实验室。中午时分,韩春雨接受了《知识分子》的访问。

槐北路43号,韩春雨任教的河北科技大学门牌。摄影:陈晓雪

  自称两次重复,“我的实验没问题”

  在河北省药用分子化学实验室二楼的一个会议室,不等《知识分子》提问,韩春雨首先表明态度:“重复率低和不能重复是两码事,重复率低不代表不可重复。这两个是本质的差别。”

  他进一步表示,“小保方晴子那个(实验)是全球没有一家做出来,然后学术委员会才介入调查,而我这个是明明有人能做出来,我们学校其实还找过其他几家实验室,有确凿的证据,因为(他们)是做出来感兴趣来联系我们,然后我们有一些技术、有一些改进,可以跟他们分享。”

  据韩春雨讲述,自己是在7月份听到国内外大面积不能重复自己文章结果的事情,也曾经怀疑过自己:“是不是我做错了”。当《知识分子》追问“错了”的含义, 腾讯分分彩漏洞“可能看到的是一个假阳性结果”,韩春雨解释说,但强调“这个得用实验来说明。我现在基本能确定不是我实验室材料的事,发文章用的实验材料是没有问题的”。

  韩春雨否认此前曾对《科技日报》记者讲过,自己“论文发表之前按要求重复过实验“(《科技日报》10月10日报道),而称“目前没有收到(《自然·生物技术》)编辑部要求做可重复实验,(编辑部)也不会提出这样的要求”,但自己确实在论文发表后成功重复过两次实验。“一次是在论文发表后,一次是在前一段时间,都在一周左右的时间完成。”

  当被问及是否《科技日报》记者编造了访谈内容时,韩春雨表示,“他(系指《科技日报》记者,编者注)的这个理解是错的,而且我反复说,不要去报道”,“我一般脑子里都在想着实验怎么去做,跟你们说这些事情的时候,我不是专门的新闻发言人,无法做到特别准确”。

  “也就是说,有可能是你说错了?”《知识分子》问道。

  “说错了,这是很正常的。”韩春雨回应。

  “那还有哪些地方是你说错了的?”《知识分子》追问。

  “……”韩春雨低头笑了笑,“这是一特烧脑的事儿”,之后不再回应,转而继续强调:第一,实验是可重复的,只是重复率低;第二要通过实验去找到重复率低的原因;第三,NgAgo目前遇到的困境与相关背景研究少,与Cas9作为基因编辑工具前已有较为充分的研究不同。

  然而,通常生物学实验不能重复的原因可能很多,找出别人不能重复实验的所有原因几乎是不可能完成的。而韩春雨自己也承认,“如果这个原因好找的话,那12个科学家早就找出来了”。

  但与此同时,他拒绝自己的实验室公开做重复实验,对于这种“自证清白”的做法,韩春雨认为“这个事如果去做的话就是一个有罪推论的事情”。他说,“我实验室本来很小,推进就很慢,这样就会干扰我实验室的正常运作。(这件事)有更好的办法可以解决。我希望找出确凿的(细胞)污染源,这样的话别人也能做出来。”

  对于外界猜测其可能造假的有关说法,韩春雨曾在10月10日晚上的电话里表示:首先我没有造假,其次我想弄清楚我的实验是否不严谨,我现在基本上有初步的实验结果,我的实验是没有问题的。

  当《知识分子》求证其是否“能够重复自己的实验,而且实验结果不是假阳性”时,韩春雨表示,“这个还是比较能确定的。之前我没有做实验的时候我不能说这些话。我还是因为前一段时间做了实验,才能有这个判断,才敢跟你说这个话。”

  但对于“是否完全排除假阳性结果”的追问,韩春雨的表态显得谨慎了一些:“应该说,我还要再进一步把它确实了,也许我应该用发文章的方式把它公开。”

  细胞污染疑云

  国内外大量实验室为何无法重复其实验? “细胞污染”是韩春雨向同行和媒体常说的一个原因。

  “别人可能会有疑问,怎么这么多人手里的细胞都是有问题的?我也从各种渠道购买,或者也从别人手里要了实验材料,把原来整个实验捋一遍,做一遍,确实发现,他们说做不出来确实是有原因的,我现在基本上确认其他实验室不能重复出来实验的一个很重要的原因是细胞污染,但我还要通过更严谨的实验去把这些东西找出来。”韩春雨解释道。

  “细胞污染是一个挺严重的事情,它曾经对世界上很多科学家造成困扰,Nature有过专门的报道。”韩春雨强调说,“我做这个事情就是对12个实名科学家的回应。”

  目前,韩春雨集中精力“在分析判断别人的(实验用)细胞和我手里的细胞”,“我希望找出确凿的污染源,这样的话别人也能做出来”。

  据韩春雨实验室的一位工作人员说,韩老师每天都在实验室泡着,晚上很晚才回家。在与《知识分子》通电话的当晚,一直工作到次日凌晨三点。

  韩春雨告诉《知识分子》,自己目前最主要的时间都花在做实验上,“但是做实验的时间也不多”,“我整个八月份几乎没法在实验室干活,总有电话,会有记者堵门”。“我需要时间,需要一个安静的环境”。

  当《知识分子》再次问及在其成功重复的两次实验中,是如何处理细胞污染问题时,韩春雨表示,自己在发《自然·生物技术》论文之前也遇到过类似的细胞污染的问题,但拒绝透露自己解决问题的“秘诀”,“我只能说将来我会以比较严谨的科学报告的方式去(回应)”。

  究竟谁重复了实验?

  2016年8月,经历国内外多家实验室无法重复实验的质疑高峰后,韩春雨接受了自然新闻亚太通讯员David Cyranoski的采访,并提供了5位据称可以重复实验的中国科研人员名单。

  最终有三位匿名的中国科研人员出现在自然新闻的报道中。其中一位表示在好几个细胞系检测了NgAgo系统,而且结果显示NgAgo能够在预期的位点诱导遗传突变,但NgAgo系统的效率并没有比CRISPR-Cas9高,可能还要后续调整改进。另有两名科学家称有了一些初步的试验结果显示NgAgo是有效的,但是仍然需要进一步测序去确认。

  9月6日,《成都商报》刊发了对韩春雨的专访,韩春雨称“《自然》杂志已经证实实验可重复,但还有不确定因素影响实验结果”。 随后,David Cyranoski本人表示自然新闻的报道不能作为韩春雨实验可重复的证据。

  究竟是谁已经重复了实验,韩春雨对此一直讳莫如深,不愿多谈,只是声称河北科技大学也“明确知道哪几家(实验室)做出来了,和实验室都有接触”。

  当《知识分子》追问:能够重复的实验室是如何解决细胞污染问题的?韩春雨欲言又止,表示这一问题“涉及到人家的机密”,并补充道:“都是在某些特别干净的细胞里做出来的”。

  在接受《知识分子》访问时,韩春雨拒绝公开究竟谁重复了实验,理由是“因为前一段媒体报道,做出来就会被骚扰一通这个事很不好”。

  事实上,由于外界普遍不知哪个实验室重复韩春雨实验结果成功,这样的骚扰是否发生无法求证。韩春雨坚持认为公开已经重复实验的实验室并不是好办法,他向《知识分子》描述了心目中解决问题的最好办法——自己做实验“解决掉一些问题,或者提出一个办法”,再找另外的第三方实验室重复实验,既保全目前“已经重复实验”的合作伙伴,又解决大家不能重复存在的问题。

  韩春雨说,这一过程“大概需要20天时间左右”, “20天的时间可以发生很多事情”,但他不愿详谈具体会发生什么。

  回应13位实名科学家:他们应该帮我

  对于韩春雨论文中NgAgo实验的结果,韩春雨坚持它是“可重复”,只是“重复率低”。重复率低是什么概念?韩春雨的解释为:“重复率低是能做出来的,但是很多人做不出来。”但是,他又补充说,到目前为止,他并没有看到一个相关的科研的定义。

  《知识分子》询问,在发表论文之前是否碰到过重复率低的问题,韩春雨坦言,“这个之前没有碰到过”,但同时表示,“这是一个我特别不愿意去回答的一个问题”,原因是担心被人误读。

  韩春雨称使用自己培养的细胞能够高效地实现NgAgo基因编辑,而从“某些权威机构买来的细胞确实有很大的问题”。

  谈到所谓“高超的实验技巧”,韩春雨解释道,他在论文中论述过,不同的细胞表达NgAgo蛋白的速度、高峰期不同,而Ago必须一边表达一边与guide (指guide DNA)结合,而不像Cas那样的可以随时结合guide,一旦错过这个窗口期,Ago表达过了没有结合guide,再结合它就没有活性了,因此它的效率将会降下来,这是一个操作的难点,需要花一番力气摸索。

  在发表论文前,韩春雨自述曾用两到三个月的时间让实验做到高效,他同时表示,“当时就没想到细胞污染这事,因为当时我们细胞是不污染的。”

  但当被问到有没有实验记录以佐证其实验成功率时,韩春雨说,“我们的条件非常有限你知道的,有时要用公共实验室的(仪器)。我们只是把数据扫在电脑上,有些是能扫的有些是不能扫的。”

  “也就是说,实验记录并不是完整的?”面对《知识分子》的提问,韩春雨再次回避:我们实验室很穷。这个我绝对不能在外面这么说。

  谈到迄今共计13位没有重复实验的国内同行实名质疑,韩春雨表示,“全世界的科学家都会面临重复性的问题,包括Cas9也有这个重复问题。因为直到现在,也有些实验室一直做不出来,或做不好。他们知道我是有重复的,应该帮助我一块解决这个重复率低的问题。不应该让我一个人去帮助他们那么多人。”

  “实际上,只有你和河北科技大学知道哪几个实验室是能重复的。这13位科学家是不知道的。”《知识分子》再次问及“实验可重复”之谜。

  韩春雨说:“这个……在适合的时机……,而且他们也从来没有联系过我,如果他们单个人联系我的话,我会告诉他谁谁谁做得出来。我们可以私下商量。但是他们从来没有找过我。”

  《知识分子》继续问道:“是不是说,请一位科学家今天来联系你,你可以跟他讲一讲,谁重复过这个实验?”

  韩春雨回答:“嗯。他可以来我的实验室。好多是北京的离这么近,他直接来就行了。一起来解决重复率低的问题。这个我会特别高兴的,这是我特别希望的。”

  《知识分子》追问:“这么长时间以来,大家都有质疑,但他们都没有跟你联系过吗?”

  韩春雨回答:“当时还是不少人来实验室的,要走质粒,然后我也会说一些技术细节。但我那会儿也不知道(不能重复)是(细胞)污染造成的。说实话,那段时间那么忙乱,也没法做实验,都在应酬这个。后期是被骚扰无法做实验。自从那次去北大(指5月27日韩春雨应魏文胜之邀在北大作报告)之后回来,这些人都没有和我联系过。”

  第三方立即介入调查将是“最大危机”

  8月9日,河北省发展和改革委公示“原则同意”河北科技大学基因编辑技术研究中心建设工程项目建议书,批复公文显示,该中心总建筑面积2.52万平方米,总投资达2.24亿元。

  9月23日,澎湃新闻报道称,该中心2000万设备招标被举报存在暗箱操作。

  对于此事,韩春雨的回应是,“这些我都不参加。现在学校能运作就让学校运作了。主要我在实验室干活,光这个就不够干了。”

  而对于当前各方呼吁的第三方调查能否发生,韩春雨再次强调,“重复率低,不是不可重复,它是两回事。就是什么调查之类,是不可重复才要进行的事情。”

  “最大的危机是,还没等我弄清楚这些问题时,第三方就介入调查,这个我就麻烦了,因为我得去把这些问题搞清楚,第三方调查时间很长,才能搞清楚。我希望我有了结果之后,直接找第三方重复实验,这是最好的。”韩春雨说。

  在近两个小时的访谈最后,《知识分子》问道:如果最后验证实验真的假阳性结果,你怎么办?

  “如果是假阳性,连编辑基因组这件事都不能做,我肯定撤稿,如果有部分假阳性,我申请更正。这都是正常的,我发现实验中有问题,我就去更正,这在科学中也经常发生。”韩春雨说。

  韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界

  韩春雨的实验室在河北科技大学槐北路校区,而不是生物科学与工程学院所在的新校区,韩春雨办公室的工作人员介绍说,这是因为韩春雨的家就在附近,为了做实验方便。摄影:陈晓雪

  总述

  今年5月,因为一篇刊发在《自然·生物技术》的论文,河北科技大学副教授韩春雨以一夜成名的姿态进入公众的视野,一方面其论文报告了一种可以与国际生物学界流行的基因编辑技术CRISPR-Cas9相媲美的新的基因编辑工具,另一方面也因为韩春雨本人之前籍籍无名,而他所在的单位河北科技大学长时间处于科研前沿的洼地,少有重大科技成果的产出。

  研究成果的重要性与研究者背景之间的强烈反差,让这一故事充满戏剧性,令人倍感振奋。

  《知识分子》较早以特稿形式报道了韩春雨发表的这篇突破性论文,多家媒体也纷纷赶到河北科技大学采访韩春雨实验室;协和医学院、北京大学、浙江大学等高校或研究机构邀请韩春雨做报告;有的实验室直接派人飞到河北石家庄,第一时间与韩春雨实验室建立联系……

  然而,这一被寄予厚望、获得高度评价的研究很快备受质疑。

  距离韩春雨论文发表不到一个月,有人在网上称做重复实验一周无法看到论文报道的结果;质疑接踵而至,国内外多家实验室纷纷报告无法重复韩春雨实验或在其他细胞系内检测不到NgAgo基因编辑的效果;10月10日晚,12名中国科学家实名通过媒体发表声明,称经过多次实验无法重复或再现韩春雨论文的结果……

  今年7月底,《知识分子》注意到韩春雨等人文章面临的可重复性争议,开始陆续询问国内外多位曾经测试过NgAgo基因编辑活性的科学家,其中不乏基因编辑领域的小同行。他们介绍了自己实验室测试NgAgo的过程与结果:

  8月1日,中国科学院动物研究所的研究员王皓毅称,他的实验室首先在小鼠中对NgAgo进行测试发现“不工作”,之后对韩春雨论文的实验进行了部分复制, “一开始有一点点阳性结果,但后来重复就重复不出来了”。

  8月1日,北京大学生命科学学院研究员魏文胜称,他的实验室在对韩春雨的论文进行多次重复之后,“实验结论是完全不工作,没有任何疑虑的不工作”。

  8月2日,美国霍华德休斯医学研究所的大卫·斯特恩(David L。 Stern)称,他的实验室在果蝇中对NgAgo进行了测试,“不像论文中说的那么有效”。

  8月2日,澳大利亚国立大学的科学家加埃唐·布尔焦(Gaetan Burgio)称他在小鼠身上没有看到NgAgo编辑基因的效果。

  9月28日,美国有教授称,他利用NgAgo试图在细胞上和小鼠上编辑基因的三次实验全部失败。他不愿公布自己的名字和所属机构。

  10月6日,荷兰瓦赫宁恩大学的微生物学家约翰·范德欧斯特(John van der Oost)称,到目前为止没能再现韩春雨论文结果。

  ……

  无可争议的是,韩春雨发表在《自然·生物技术》的实验结果的可重复性存在巨大的争议,而且到目前为止,《知识分子》所联系到的国内外十余家实验室没有一个表示自己已经可以完全重复或再现韩春雨论文的结果(其中一些实验室在谈完后要求匿名或不做公开报道)。

  在此,《知识分子》选择披露这一历时数月向学术界求证的历程,旨在记录这一段争议的历史,并期望这一事件最终按照科学的规范得到合理的解决。

  在本文中,我们关注的核心问题是:

  韩春雨《自然·生物技术》论文的实验结果是否可以被重复和验证?

  一项新的研究遭到众同行质疑,一个科学的解决方法应该是什么?

  

  2016年5月2日,河北科技大学副教授韩春雨与合作者在《自然·生物技术》报告了一种新的基因编辑工具NgAgo,能够在哺乳动物的细胞中编辑基因组的DNA。

  这一研究甫一出现,就在中国科学界引起了巨大的轰动,不仅仅在于韩春雨等人找到了一种新的基因编辑工具,更在于论文报告的NgAgo所呈现出来的潜在能力。

  在此前的研究中,具有酶切活性的Ago蛋白都是从嗜热菌中发现的,只有在65°C以上的高温环境下才能生效,因此无法在哺乳动物体内使用而应用价值不高,而韩春雨的论文则找到了一种可以在常温下(37 °C )实现基因组编辑的Ago同源蛋白,使其展现出了广阔的应用前景。

  在此之前,CRISPR-Cas9是基因编辑领域的明星技术。自2012年问世以来,CRISPR-Cas9经过不断的改进,因其操作简便、功能多样,已经成为生命科学领域近些年来最为重要的技术突破。世界范围内的实验室使用它精确编辑植物、动物、甚至是人类的基因组,而风险投资也看中了它在农业、医药、生物燃料等领域的潜力,多个基于CRISPR-Cas9技术的公司创立,其中以麻省理工学院教授、博德研究所核心研究员张锋参与创建的公司Editas Medicine、加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德纳(Jennifer Doudna)创建的Intellia Therapeutics以及瑞典女科学家埃马纽尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)与人联合创办的药物研发公司CRISPR Therapeutics最受关注,前两家公司已上市,最后一家亦是IPO进行时。

  韩春雨等人的研究展示了NgAgo作为一种新的基因组编辑工具的多项特性,可以减少脱靶效应的发生,并且NgAgo有着与CRISPR-Cas9可以相媲美的效率,甚至某些时候效率更高。

  在NgAgo身上,人们似乎看到又一个明星技术呼之欲出。

  5月7日,韩春雨向《知识分子》表示,现在的NgAgo“还是最原始的版本,和Cas9刚出来的时候是一样的,以后也会有全世界的实验室对它进行改进的”,他还透露,正在进一步优化NgAgo,并准备在有了新的进展之后投稿。

  

  韩春雨论文发表后,世界各地的实验室对NgAgo充满了热情,许多实验室在第一时间投入到测试NgAgo的实验中,但质疑声也随之而来。

  5月27日,在最早讨论韩春雨工作的论坛未名空间(),一ID为“zhouyangq”的用户称,经过一个星期的重复实验,未看到韩春雨《自然·生物技术》论文中报道的结果。

  此后,网上开始不断出现声称不能重复韩春雨论文结果的帖子。7月29日,澳大利亚科学家布尔焦公布自己测试NgAgo的实验过程,表示不能重复韩春雨论文中的Fig.4(图4)的结果。

  加埃唐·布尔焦博士是澳大利亚大学约翰·克汀医学研究中心(the John Curtin of Medical Research)一个研究小组的负责人,同时也是澳大利亚表型组学设施中心(Australian Phenomics Facility)基因改造设施中心的负责人。布尔焦的实验室主要利用下一代测序技术、CRISPR-Cas9基因组编辑等前沿遗传学技术,研究小鼠模型研究宿主与病原体之间的互动。

  和很多人一样,《自然·生物技术》刊发韩春雨论文那天,布尔焦了解到NgAgo。“我认为这个结果非常有趣,值得一试,这可能对实现我们的基因组编辑工作有用。”8月3日,布尔焦8月3日通过邮件告诉《知识分子》。

  韩春雨论文结果显示,NgAgo可在人体细胞中进行基因编辑。布尔焦的实验室没有选择重复韩春雨论文中的实验,而在小鼠胚胎中测试NgAgo的基因编辑效果。布尔焦说,他希望能够比较NgAgo与CRISPR,评估NgAgo的表现是否可以用于实验室的研究工作。

  7月15日,布尔焦在推特上发表了一组数据,认为自己确认再现了韩春雨的实验结果,但随后遭到很多同行的质疑。布尔焦告诉《知识分子》,他在推特上公布的这一图片起初似乎提示基因组被编辑了,但当通过进一步测序,他发现“绝对可以排除编辑基因组的这个选项”。

  “我没有在人体细胞中重复韩春雨的工作,但我在中国和其他地方的一些同行进行了重复,但不幸的是没有成功。”布尔焦说。

  7月29日,布尔焦发表博文称,他的实验室过去两个月尝试以小鼠为动物模型对NgAgo进行测试,发现NgAgo无法在小鼠受精卵实现编辑基因组的效果。他一并公布了其测试NgAgo的整个过程以及部分实验数据。

  布尔焦测试NgAgo的经历被国内多家媒体报道引用,一时对于韩春雨实验不能重复或重现的质疑达到顶峰。

  布尔焦强调说,他并不认识韩春雨,没有见过韩春雨本人或他的团队成员,也没有和韩春雨有过任何的邮件来往或其他互动。

  “更重要的是,我绝对没有反对中国科学。我在中国有很多科学家朋友,他们都非常聪明、智慧、出色。”布尔焦说,他并不是反对NgAgo,也与CRISRP和NgAgo之间的战争无关,发表那篇博文是想开放自己的实验,让每个人都可以评论,提高自己的工作。

  一位在美国某生物医学实验室做研究的博士后看到布尔焦的博文后说,“(实验)桑格测序的深度不够。看Ago有没有编辑效果,应该做靶点测序,并且要有平行的阴性对照。另外,他的博客上没有显示出阳性对照,同样的靶点位置,设计一个Cas9的sgRNA,同样的实验手段,然后进行肩并肩(side by side)的比较,才更有说服力。”

  《知识分子》把这些意见也反映给了布尔焦。他表示,这些桑格测序的曲线显示出模糊(的噪音),这不可能是编辑的结果;同时,他也以CRISPR做了阳性对照和阴性对照,只是在博文中没有贴出来。

  “到目前为止,这还是一个非常正向的实验。很多人就我实验中的错误、应该如何做实验提出建议。这通常发生在发表一篇科学论文的同行评议过程。在这里,我已经决定,不追逐期刊发表,而是和每个人分享我的数据。这是一个开放同行评议的过程。”布尔焦说。

  布尔焦表示,他现在还不确信NgAgo是否能够或不能够编辑。“它确实对细胞发生了作用,但我对NgAgo如何工作仍感到困惑。它未来也许会是一个潜在的基因组编辑工作,但目前仍需要大量的改进。”布尔焦说,“现在,我的感觉是坚持CRISPR-Cas9,等待NgAgo更多的发展。”

  8月4日,布尔焦博士给《知识分子》的邮件回复中表示,他仍在继续做实验测试NgAgo,“我之前的实验有一些要素(elements),我正在尝试着去理解它们。” 8月5日早晨,布尔焦更进一步回复说,“看看这个酶到底有什么功能”。

  10月17日,布尔焦告诉《知识分子》,为了检测实验中出现的indels是NgAgo导致的还是随机扩增引起的,他还在继续尝试NgAgo,并对韩春雨在Addgene上提供的质粒做了一些改进,在细胞系和小鼠受精卵中检测基因编辑的效果。“这将需要几周去完成。”同时,因为他自己已经放弃了NgAgo这一技术,“检测NgAgo在我的实验室优先权非常低”,“进展缓慢”。

  

  7月29日,布尔焦关于NgAgo实验的博文发表不久,西班牙高等科学委员会(CSIC)下设的国立生物技术中心(Centro Nacional de Biotecnologia)的科学家路易斯·蒙特柳(LIuis Montoliu)在推特(twitter)上转发了他的博文:“赞誉送给布尔焦,他分享了自己的经历,对基因编辑来说,NgAgo不像当初预期的那么好使。”

  资料显示,蒙特柳是位于西班牙的国际转基因协会(ISTT)的共同创始人,并从创立到2014年担任该协会主席。蒙特柳的实验室主要做哺乳动物基因组和转基因动物研究。

  蒙特柳在推特上说,在NgAgo之前,他的实验室曾花了近两年时间尝试测试TtAgo(Ago家族的一种蛋白),但无法实现基因组编辑。他在推特上说,“在布尔焦和众多(实验室)使用NgAgo出现相似的阴性结果后,《自然·生物技术》应要求原文作者分享原始数据和(实验)条件。”腾讯分分彩官网

  随后,网上开始流传蒙特柳发给国际转基因协会成员的一封邮件,邮件名为“对Ago非常失望:CRISPR万岁!”邮件说,6月初,NgAgo通过全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene发布后,蒙特柳的实验室就开始尝试这一新工具,“但是不久发现事情不对”,NgAgo不像报道的那样起作用。“在科学和技术层面我完全信任的一些同行开始认为,他们无法重复韩的论文结果。”邮件显示。

  邮件中还有一句话被加粗:“NgAgo在哺乳动物细胞内不能编辑基因”。

  7月31日,蒙特柳的邮件被多家媒体报道引用。

  8月3日,《知识分子》邮件联系了蒙特柳教授,询问邮件的真实性,以及邮件中显示的一个针对CRISPR与NgAgo效果的调查来源。

  蒙特柳回复说,他不评论为了科学目的发送给协会内部的私人信息,“这些邮件都没有打算公开投递,却未经许可发表在了公共领域”。

  根据财新传媒的报道,蒙特柳对NgAgo进行了初步测试,但他很快意识到,实验的结果与韩春雨文章描述的不一样。

  “我认为韩春雨博士的工作表现得非常令人激动,充满希望。他在《自然·生物技术》发表的论文令人信服地表明NgAgo可以进行基因编辑。我们都祝贺他的这一工作。然而不幸的是,世界范围内的许多实验室目前的证据认为,NgAgo不能正常工作。我希望这种情况可以得到解决,科学地解决,很快地解决。”蒙特柳在给《知识分子》的回复中说。

  

  7月29日,美国科学家大卫·斯特恩(David L。 Stern)也在推特上转发了布尔焦的博文,“NgAgo不像说的那样有效。(布尔焦的结果)和我在果蝇上的初步结果一致。”

  斯特恩是美国霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)的遗传生物学家。他的实验室位于美国维吉尼亚州劳登郡的珍利亚农场研究园区,主要研究果蝇的形态演化与发育生物学。

  8月2日,《知识分子》和斯特恩博士取得了联系。

  斯特恩在邮件回复说,他5月上旬读到了《自然·生物技术》发表的韩春雨关于NgAgo的论文。之后,他的实验室就开始着手准备使用NgAgo编辑黑腹果蝇的基因组。

  斯特恩博士向《知识分子》描述了实验的过程。他首先合成了经过果蝇密码子优化的NgAgo,将其克隆到表达载体中。之后,他在体外转录了NgAgo的mRNA并将其注射到果蝇胚胎中。同时,他还订购了磷酸化的 gDNA,而这段 gDNA能够靶向一个之前被证实过的适合 Cas9编辑的位点。他将注射了靶向 Ubx 基因的 Cas9的 mRNA和 gRNA作为对照,在另外一组胚胎中注射了靶向相同位点的 NgAgo的 mRNA和 gDNA。“实验中的mRNA都按相同的浓度注射,gRNA和 gDAN也按照相同浓度注射。”斯特恩说。

  斯特恩发现,所有注射Cas9的胚胎都长出了突变的个体,而注射了NgAgo的胚胎没有一个出现突变的表型。随后,斯特恩又将这些果蝇又传了一代,每个注射了Cas9的个体都产生了突变的后代,而注射了NgAgo的后代则都没有产生突变的后代。

  “NgAgo是否像发表的一样有效,我没有确切的数据,因为我没有尝试精确复制论文中的实验。在一些条件下,NgAgo也许能够在gNDA的介导下精准地切割DNA。”但是,“很明显,即使NgAgo发生作用,在这样的实验条件下,它的效率不如Cas9”,斯特恩总结道。

  在果蝇胚胎测试NgAgo失败之后,斯特恩与韩春雨做了一些沟通,后者给出了几个提高NgAgo效果的建议。但是,斯特恩说,“基于许多研究小组都没能观察到NgAgo能够编辑基因组的结果,我不可能继续使用这一工具”。

  

  “当时看到这篇文章非常惊讶,而且激动,因为第一眼看到这篇文章的data(数据)是almost too good to be true(几乎非常好,应该是真的),我们第一反应是相信这篇文章的。” 8月1日,在成都参加第11届华人生物学家协会双年会的中科院动物研究所研究员王皓毅对《知识分子》说。

  王皓毅马上给韩春雨发了邮件和短信,希望建立合作,但并未得到韩春雨的回复。“他没有回复,我也可以理解,他应该是收到各方面很多信息无法一一回复”。王皓毅回忆说。与此同时,王皓毅本人还写了一篇热情洋溢的文章介绍NgAgo,称之为“一个激动人心的基因组编辑新工具”, 《中国科学》(Science China)2016年6月17日在线发表了这篇文章。

  王皓毅的实验室自己克隆了古菌的NgAgo基因,并且基因合成了人源化的NgAgo,开始在人类293T细胞系中尝试文章中针对GFP质粒以及内源基因的基因编辑实验。在经过大约一两周的实验后,王皓毅的实验室发现, “和很多同行一样。我们看到针对GFP在质粒上的表达是有抑制效果,但对于内源基因的编辑检测不到”。而进一步的实验也无法检测到GFP质粒上的突变,同时control(对照)组的结果表明单链guide DNA本身就对GFP表达有很强的抑制作用,因此GFP的抑制很可能是假阳性的结果。

  之后,他派了自己的学生去韩春雨实验室取质粒,重新在人类293T细胞系中尝试重复利用韩春雨的NgAgo质粒进行基因编辑,但是也没有看到韩春雨论文的结果。

  后来,王皓毅和韩春雨一起参加在北京举行的香山会议。说到实验重复困难的问题,王皓毅说,韩春雨当时回答说实验中需要注意转染的时间,观察的时间可能要久一点,另外做序列分析的DNA需要银染。“我们尝试了一些,各种不work(工作),”王皓毅说。

  与王皓毅一起向《知识分子》介绍实验情况的还有中科院上海神经科学研究所的研究员杨辉。杨辉的实验室对小鼠胚胎进行了三轮实验,用了三个不同版本的NgAgo(密码子优化或者NLS在N端、C端),在细胞上尝试了韩春雨论文中的两三个基因,操作了几百个胚胎,“但是没有效果”。

  魏文胜第一次出现在《知识分子》,是受邀评价韩春雨发表在《自然·生物技术》的工作。 “这篇文章比较聪明,还是走对了路,没有研究如何使高温才能工作的酶通过构象改变达到降温,而是找到这样一株可以在37度工作的Ago。” 5月7日深夜,魏文胜通过微信告诉《知识分子》。

  魏文胜主要从事基因组编辑技术的发展与应用研究。他的课题组也曾试图从Ago家族寻找合适的同源蛋白。随后,魏文胜邀请韩春雨到北京大学生命科学学院做报告,并亲自主持了5月27日的这场报告。

  8月1日,《知识分子》再次联系魏文胜。他告诉我们,从5月上旬开始,他的实验室多次根据韩春雨论文中的实验方法在不同的细胞中做基因编辑的测试,“开始想的是效率很低,但还是工作的,结果我们到最后测序了一下发现完全没有编辑”。

  10月10日晚上,包括魏文胜、王皓毅和杨辉在内的12位科学家(后哈尔滨工业大学教授黄志伟加入,变为13名)通过《中青在线》和澎湃新闻实名发声,宣布他们未能重复或再现韩春雨论文中的实验结果,呼吁有关机构组织第三方介入调查。

  

  今年5月第一次看到韩春雨等人的论文时,约翰·范德欧斯特(John van der Oost)感到既惊讶又激动。

  荷兰瓦赫宁恩大学(Wageningen University)的微生物学家范德欧斯特是世界范围内最早开始研究CRISPR领域的科学家之一,与麻省理工学院博德研究所的张锋和加州大学伯克利分校詹妮弗·杜德纳(Jennifer Doudna)均有过合作。2014年,范德欧斯特与合作者首先报道了嗜热细菌T.thermophilus的Ago(TtAgo)具有在5’端磷酸化短单链DNA片段引导下切割靶DNA的能力;2015年,他的实验室又报道嗜热古菌P.furiosus的Ago(PfAgo)也具有类似的能力。不过,这些Ago的来源都是嗜热菌,这决定了它们只能在高温环境下(65摄氏度以上)进行反应,而无法应用到哺乳动物的细胞系统。

  韩春雨团队有关NgAgo的发现也正是建立在范德欧斯特小组2014年工作的基础之上。

  “我们对他们发表的切割活性感到很惊讶,因为这与我们以前观测到的其它细菌中的Argonaute(简称Ago)蛋白的活性并不同。”8月1日,在给《知识分子》的回复中,范德欧斯特说,他的实验室正在尝试利用NgAgo进行基因编辑,但还没有结果。

  9月9日,范德欧斯特在给《知识分子》的回复中说,“我们将在下一周得到更多结果。”

  10月6日,当《知识分子》进一步询问范德欧斯特关于NgAgo的实验进展时,他说:到目前为止,我们无法再现NgAgo蛋白的活性。在第二天的回复中,他补充说,他的实验室还没有放弃NgAgo,仍然在试图利用NgAgo在体外切割(DNA)片段和质粒,但是,“到目前为止,我们无法重复刊发的数据”。

  “一开始,我对论文感到非常激动,现在我有些怀疑。如果韩教授能够置评一下就好了。”范德欧斯特说。

  

  国内一位要求匿名的生物学家今年6月开始尝试利用NgAgo编辑几种哺乳动物细胞系基因组中的基因。

  在经历过几个细胞系上的失败后,“我们观察到针对绿色荧光GFP基因的NgAgo处理的人iPS细胞(基因组内有预先嵌入的绿色荧光GFP基因)有一些细胞绿色荧光降下来了。这个结果不奇怪,因为很多组发现Ngago系统有敲低现象,而没有基因组编辑”。

  经过深度测序,他发现Indels有存在,但是效率比Cas9低数倍,“而且发生的位置也很奇特”。 “第一,同组相应位点有Cas9的正对照,而且负对照组没有Indel出现,虽然可能性不大但是从科学严谨的角度,我们仍然担心可能存在Cas9系统污染到Ngago组的情况;第二,我们也担心我们当时的生物信息学的分析方法不够好,原因是我们第一轮扩增的时候,没有用带Barcode(单分子标签,指一种在测序文库建立过程中加入的DNA序列,用于在后续分析中唯一确定测序模板的来源)的引物,所以我们不能确定每个拷贝携带Indel的序列从哪里来”。

  10月10日,这位科学家告诉《知识分子》,正是因为实验上的这些疑点让他目前不能给出任何确切结论。

  “我们刚开始的想法很简单,在iPS细胞里做点编辑,验证这个Ngago系统是否和Cas9一样,就结束这个项目”。没想到的是,在与同行的交流中,他得知有大量的实验室无法重复出韩春雨论文实验的结果。

  目前,这位生物学家的实验室正在进行新的一轮测试,“将采用更严格的测序方式,希望这次基本能够告诉我们上一次看到的是不是真的”。

  “最开始做这个是希望中国原创的东西真的好用,到现在这个程度,基本上就变成了我们出于想知道这个事情到底是怎么回事,心理上有个交代。这是现在唯一的motivation(动力),毕竟也耗费不少时间和精力。”他说。

  

  对于NgAgo可重复性的争议,国际学术期刊《细胞研究》(Cell Research)常务副主编李党生博士8月1日向《知识分子》表示,鉴于这篇论文及其所报道成果的受关注程度,论文的作者应尊重试图重复过这个实验的科学家们提出的疑问,尽可能帮助科学共同体消除疑问。

  李党生介绍了国际期刊对于争议性研究的一般处理模式。

  一是如果论文确实存在严重问题,通常原作者会主动澄清错误,要求撤稿。

  还有就是其他人挑战原研究的主要结果,一般是以类似于“论文”的形式把挑战的文章提交到原论文发表的期刊。这类的挑战文章若通过了同行评议并得到发表,期刊也会邀请原论文的作者给出书面回应;通常原论文作者的回应会和挑战文章一起刊出。

  如果原论文的作者不想回应,期刊则单独刊发挑战的文章。无论回应与否, 这类挑战文章的刊出会提醒科学共同体注意相关研究结果或结论存在争议的事实。

  李党生说,科学上的争议的最终解决只能靠科学共同体的进一步验证。

  李党生同时也表达了自己对于科学报道的看法。他认为,无论是肯定一个研究还是否定一个研究,都要小心审慎。

  “一个新的研究成果刚发表出来,在未经进一步验证前就被肯定到了吹捧的地步,是科学不成熟的表现。”李党生说。

  他强调,报道新的研究,尤其是一个高度吸睛的研究成果,一定要审慎,因为所有的科学结果发表出来以后,都需要科学界的进一步验证。反之亦然,如果没有确凿的证据,仅通过媒体来质疑甚或“审判”一个经过同行评议的研究,“对原论文的作者来说恐怕也不见得公平”。

  “一个新的研究成果做出来,科学家和公众有批评的自由”,但是科学上的问题最后还是要由科学共同体来解决,而不是由媒体来评判,李党生强调说。

  10月12日,魏文胜告诉《知识分子》,包括他在内的多名科学家已经在汇总各自实验室测试NgAgo的实验数据,将在近期向《自然·生物技术》提交联署文章,反映无法重复或再现韩春雨实验结果的情况。

  一位来自北京某高校实验室的负责人也向《知识分子》介绍了其实验室在斑马鱼受精卵和细胞上尝试NgAgo失败的过程,但是他希望能够通过《自然·生物技术》直接交流,而不是通过媒体报道的方式解决这一争议。

  

  10月14日,河北科技大学通过河北新闻发布了一份“关于舆论质疑韩春雨成果情况的回应”,声称“已经有独立于我校之外的机构运用韩春雨团队的NgAgo技术实现了基因编辑”,并“恳请社会各界提供和谐宽松的舆论环境和文化氛围,给予他们多一点支持、多一点时间、多一点耐心”。

  一位要求匿名的科学家告诉《知识分子》,对于韩春雨论文的可重复性争议,一个实验室或几个实验做出来或做不出来,都不能直接证明韩春雨的实验结果是否可重复。

  “一定要由第三方公正地去做检验”,他认为,韩春雨所在机构河北科技大学或经费资助方自然基金委都可以组织第三方进行调查,“一定要在第三方公正客观的监督之下,让所有人都信服”。

  然而,国家自然基金委很可能不是韩春雨实验的直接资助方。根据10月15日的《凤凰资讯》的报道,韩春雨论文的合作者、浙江大学研究员沈啸首次公开回应争议称,“按学术常规论文的所有作者都必须在论文的‘致谢’部分标明自己的基金来源。我标注了我的基金,韩春雨没有基金。但这个研究基本上是韩春雨通过各个渠道自筹的,我的资金没有投入实验部分。”

  10月13日,在接受《科技日报》采访时,中科院微生物所研究员、中科院院士高福说,众多科学家反映自己无法重复韩春雨论文中的实验,“韩春雨有义务、有责任帮助大家完成实验,包括公开他掌握的数据和实验过程。”他同时向《科技日报》表示,“河北科技大学和相关部门必须站出来展开调查。不论是韩国的黄禹锡事件,还是日本的小保方晴子事件,最终都是他们所在的学校和科研单位进行的调查,并公布调查结果。”

  截至目前,这一场巨大的学术争议事件的调查何时到来,如何进行,甚至是否会开始,各方仍莫衷一是,考验着科学共同体的神经。唯一可以确认的是,任由争议无序发酵下去,显然将有损科学的严肃,不利于中国科学生态的健康发展。(陈晓雪、李晓明)